25微升
PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
实时荧光定量PCR——RT-QPCR
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目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法
SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：
实验试剂及耗材：
试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA
试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master
1号管包含：
热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2
仪器及耗材：
罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等
正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】
二、反转录
实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
(1)配制NTC对照：（总13ul）
水——10ul
oligo dT引物 ——1ul
随机六聚体引物——2ul
混匀
（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）
总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul
oligo dT引物——1ul
随机六聚体引物——2ul
水——9ul
混匀
【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA】
（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min
（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：
配制总mix（除了RNA模板和引物）
5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）
dNTP mix ——12ul（2ulX6管）
40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）
20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）
mix总体积——42ul（7ulX6管）
若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。
将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：
25℃ 10min
55℃ 30min
85℃ 5min
最后置于冰上停止反应。
此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响
SYBR Green 反应体系的配制：
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析。
实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）
5个反转录样品（包含1个NTC对照【Negative Template Control缩写】）
由于样本数较多，如下配置：
不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）
按照体系配方配制：
2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）
10x Primer mix —— 66ul（2ulX33）
PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）
总体积 ——594ul
用移液枪轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。
标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA，空白对照加入6ul水代替模板，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。
反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。
混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中，用封口膜盖好96孔板。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中
PCR程序设置与运行：
（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面。
（2）点击New Experiment
（3）设置反应体积（对于96孔板，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul
（4）在Program中输入反应名称preincubation，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集
（5）点击增加按钮，输入amplification，定义扩增循环的次数为445次，选择荧光的收集功能Quantification
（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s
（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s
【6.7两步 Analysis Mode默认None】
（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single
（9）设置溶解曲线，在program新的一行中输入Melting curve，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度，再点击增加按钮，65℃ 1min 以上两步Acquisition Mode默认选择None
（10）点击增加按钮，95℃ Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动
（11）设置保温的过程cooling，1个循环，无需荧光，40℃ 1min
（12）设置完成后，点击右方保存按钮，保存设置的程序
（13）点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
样品编辑
（1）实验结束，点击Sample editor，进入样本编辑程序
（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑，设置阴性对照、空白对照、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔
（3）在Sample Name中输入被选择样品名称
（4）最后点击make replicates设置复孔
（5）标准品设置时，需填写拷贝数、稀释倍数、初始浓度即可
（6）编辑好样品后，可进行数据分析，如有需要，也可进行组间分析
结果分析
（1）点击左下方的SUM，将显示出所有信息，包括设置的反应程序、实验结果分析等。
（2）点击Analysis，可对已有的数据进行细致的分析
（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax，弹出Create new analysis窗口
（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线
（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率、斜率、截距、线性关系以及错误率 （一般error值越小，说明实验准确率越高，扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好）
（6）在数据表格，可显示样本的Cp值，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计，显示Cp平均值、方差，浓度的平均值以及方差
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