食品添加剂的使用标准中对乳铁蛋白要求

   2022-09-05 14:35:02 网络430
核心提示:乳铁蛋白是食品营养强化剂,它不是食品添加剂,所以使用范围和添加量要参照食品营养强化剂使用标准GB14480来执行。乳铁蛋白在GB14480-2012中的使用范围和添加量如下:用于临床分子诊断的材料有哪些及取材时的注意事项?ELISA的实验操

食品添加剂的使用标准中对乳铁蛋白要求

乳铁蛋白是食品营养强化剂,它不是食品添加剂,所以使用范围和添加量要参照食品营养强化剂使用标准GB14480来执行。

乳铁蛋白在GB14480-2012中的使用范围和添加量如下:

用于临床分子诊断的材料有哪些及取材时的注意事项?

ELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的,无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求,都是如此。下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。

一、ELISA实验通用规则

1、要保证移液枪的准确性,误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但最好有专业人员进行矫正。

2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后,要更换枪头。即使是吸取标准品时。

3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出,使各种试剂都恢复到室温,以使结果更稳定。

4、实验时,要使底物避光保存。

5、用枪吸取液体时速度不能太快,以免产生气泡而使吸取量不准确。

6、吸取液体时,要用量程和需要量接近的枪去吸,减少误差。

7、将液体加到酶标孔中时,避免枪头和孔内液体接触,可使枪头上的液滴和孔壁接触,液滴会自然流下去。

8、液体全部加完后,可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒,混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

9、温浴时,要用不干胶或胶带纸封好酶标板,防止水分的蒸发。

10、洗板时,每次洗液加入后,应静置1分钟,使清洗更加彻底。没有洗板机时,倒去液体后,要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。

11、洗液不够时,可用蒸馏水自行配制PH7.4,0.02M的磷酸缓冲液,加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。

12、底物是光敏感的,要在临用前现配。

13、检测前,要打开酶标仪,使之稳定10分钟以上。

14、底物有一定的毒性,终止液对皮肤有腐蚀性,应尽量避免接触。

15、待检样品要澄清,否则会影响结果。

16、温浴时间应遵守试剂盒规定。

17、应尽量做双孔实验,这样才能保证数据的准确性。

18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法

1. 加入反应终止液后,没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因:未加入酶标记物。

解决办法:请按照操作步骤进行。

b.原因:试剂盒内容物未能充分回。

解决办法:确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

c.原因:室温太低。

解决办法:若室温太低(<19℃),请于操作步骤4,适当延长温育时间。

d.原因:未使用试剂盒的清洗液清洗。

解决办法: 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

e.原因:试剂盒已过有效期限。

解决办法:请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

2. 标准曲线线性不佳,或是平行性不好。

a.原因:温育位置避光不好或受到气流干扰。

解决办法: 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

b.原因:操作时间拖太久。

解决办法:请在方法熟练后再进行操作。

c.原因:微孔间相互污染。

解决办法: 加样品时,请小心勿溅出微孔外,以免造成其它微孔的污染。

d.原因:标准品或酶标记物所加入的量不一致。

解决办法:请使用已校正过的移液枪,并确保其与吸头之间有高度密合性。

e.原因:添加样品或试剂的操作方法不正确。

解决办法:加样品或试剂时,吸头请勿接触微孔。

f.原因:洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

解决办法:请随时监控洗板机洗板过程,洗完后立即进行下一步骤。

3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

a.原因:室温太高(>25℃)。

解决办法: 若无法降低室内温度,请适当缩短步骤4的温育时间。

b.原因:底物溶液受到污染。

解决办法: 若发现底物溶液已呈现淡蓝色,请不要再使用。

c.原因:反应时间超过太久。

解决办法:请控制反应时间。

d.原因:酶标记物污染了盒内其它试剂。

解决办法:使用过的吸头应立即丢弃,可避免试剂间相互污染,凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡,再以清水冲洗干净,可确保无残留)

4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

a.原因:微孔中的试剂未能充分混合。

解决办法: 试剂加完后,需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

b.原因:洗板过程发生问题(同2-f.)。

解决办法:请参考2-f.

c.原因:添加样品或酶标记物的量不一致。

解决办法: 请参考2-d.

关于遗传稳定性的疑问

临床实验室分子诊断的标准化作者:佚名文章来源:互联网点击数:132更新时间:2009-8-10转载临床实验室分子诊断的标准化李金明 卫生部临床检验中心 100730[摘要] 临床实验室分子诊断涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定,在许多临床疾病的诊断方面,有极为关键的作用。工作程序、试剂方法的标准化以及标准物质的应用,是保证实验室检验结果准确性的前提。在日常检验工作中应用标准物质,将极大地改善不同实验室间检验结果的可比性,从而逐步实现不同实验室间检验结果有条件的互认。[关键词] 分子诊断;标准化;标准物质临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域,其涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定,是临床疾病诊断中不可或缺的手段。但在临床应用中,目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异,这已成为时常困扰临床医师、患者以及实验室技术人员的普遍性问题。此外,这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。而造成不同临床实验室间检验结果差异的原因,通常包括临床标本的采集、试剂方法、测定操作、仪器设备的维护校准、数据处理及结果报告、标准物质及质控物的应用等方面的不规范等因素。然而,仪器设备、试剂生产厂家和临床实验室本身在临床实验室分子诊断标准化中起着非常关键的作用。通常,临床实验室分子诊断标准化应主要包括以下几个方面。一、 临床标本采集、运送和保存的标准化临床标本的采集、运送和保存对检验结果往往有决定性的影响,而这些问题常涉及临床实验室与其他相关科室的工作分工与协作,此点以前不太被关注或认为是难以控制的问题。但为保证得到正确的检验结果,必须制定一个规范的临床标本采集、运送和保存的程序。常用的临床标本通常有血清(浆)、全血、分泌物、组织、尿液、脑脊液及其他体液等,对这些标本的采集、运送和保存的标准化主要是对标本采集的具体方法、所用容器、采集量、采集时所用材料和用具、运送方式和不同时间中标本保存条件等做出明确而又详尽的规定,写成标准操作程序(standard operation procedures, SOP);并对参与该程序运行的相关人员进行必要的培训,及时与临床科室进行全面而有效的“对话”(包括工作沟通、定期质量评价、纠错措施),是保证所制定的程序得到确实执行的必不可少的环节。二、 临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化临床标本的处理对于分子诊断技术,尤其是核酸和基因检测是极为关键的一个环节。在抗原和抗体的免疫学测定中,临床标本中存在的干扰物质,如类风湿因子(RF)、补体及其他非特异因子等有可能会造成定性测定的假阳性或假阴性结果或使定量测定结果偏高或偏低。在检测前,对标本进行适当的稀释、加热或其他适当的预处理则可去掉这种干扰作用。在核酸和基因检测中,临床标本中存在的血红蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、乳铁蛋白、核酸酶、尿素、胆盐、黏蛋白和多糖等,都能在聚合酶链反应(PCR)扩增过程起抑制作用,而影响特定靶核酸的检测。采用简便而又高效的核酸纯化方法,去掉临床标本中的上述PCR抑制物,是保证得到正确的检测结果的前提。有些临床标本如痰[ 6,7],在核酸提取前,对标本进行适当、有效的预处理,对保证后续核酸提取以及扩增检测的成功非常关键。此外,在临床分子诊断中,必须建立一个标准化的临床标本制备处理程序,这对于核酸提取、提取的效率及能否有效地去掉PCR抑制物,也是核酸纯化方法标准化的重要指标。三、检测试剂和方法的标准化组成一个可用于临床分子诊断的试剂和方法模式,可有多种选择,如PCR因其极高的检测灵敏度,很容易因以前扩增产物或标本间交叉污染,而出现假阳性结果。此外,标本中PCR抑制物的存在、扩增仪孔间温度的差异、试剂的浓度不合适以及标本中核酸提取的失败等,则容易造成假阴性结果[1,8]。因此,试剂生产厂家在研发相应的临床分子诊断试剂时,必须仔细考虑上述因素,采用最理想的检测方法。如PCR试剂则应从如何有效避免假阳性和假阴性结果的角度出发,在试剂盒中以dUTP替代4种dNTP中的dTTP,再加上尿苷糖基酶(UNG),使扩增产物DNA中出现天然DNA中所没有的U,在新的检测扩增中,如有以前扩增产物的污染,则其可在UNG的作用下被降解。这样可一定程度地避免以前扩增产物污染所致的假阳性。又如在试剂中加入竞争性或非竞争性内标,则可有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差,从而避免假阴性结果。四、检测结果分析的标准化[9-11]临床实验室分子诊断方法依其对测定结果的表达方式,可分为定性和定量两大类。定性测定常以“有”或“无”,也即“阳性”或“阴性”来表达测定结果。定量测定的结果则以浓度(如IU/L、IU/ml、μg/L、拷贝数/ml等)的方式表达。定性测定结果确定的依据在于阳性判定值(cut-off)的建立,cut -off 值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。定量测定的依据为使用系列浓度标准品测得的剂量反应曲线(即标准曲线)或是内标的量。定性测定中设定cut-off 值是为了尽可能地避免假阳性或假阴性结果,但处于cut-off 值一定范围的测定结果具有某种不确定性,通常称为“灰区”。在临床实际检测中,“灰区”范围大小的确定以及处于“灰区”范围内的临床标本的结果如何报告,常使实验室技术人员感到困惑。因此,对其进行标准化的程序规定,不但可使实验室技术人员在报告结果时有规则可循,而且可有效减少或避免错误结果的发出。定量测定的数据处理,常采用不同的数学模式,这不仅可用来改善标准曲线绘制的精密度,从而以较少的数据和计算获得较为准确的结果,又能省时、省钱。如今微型计算机已在临床实验室中迅速普及,各种测定数据处理软件层出不穷,使得定量测定结果的表达更为准确和有效。例如:实时荧光定量PCR对阈值的设定,标准曲线中斜率、截距和相关系数的允许变化范围在其数据处理和结果报告的标准操作程序中做出明确规定。在以纵坐标为Ct值(特定靶核酸扩增曲线与阈值线相交时的扩增循环数),横坐标为起始拷贝数的实时荧光定量PCR(目前绝大部分为此类)时,斜率A = - ,其中E为扩增效率;截距B = log YCt,其中YCt为达到特定靶核酸扩增曲线与阈值线相交时的扩增循环数时的扩增产物的量。因此,斜率A与特定实时荧光PCR的扩增效率有关,当扩增效率为100%,即1时,A为-3.32,可见一个特定实时荧光定量PCR方法,其斜率应≤-3.32,越大说明效率越高。截距B则为原始模板趋向于0时,亦阴性标本检测的Ct 值,因此,一个实时荧光PCR,如果设定的扩增循环数为40,则其截距B即应≥40。理想情况下,测定数据处理报告应达到下述要求:(1)通俗易懂。要让所报告的结果,即使是不熟悉该试验的人,也能理解。(2)定性测定结果明确。即反应或不反应、阳性或阴性、在正常范围内或不正常等。(3)定量测定须有一定的线性范围。(4)处理后得到的数据要具有可重复性。(5)试验的评价不应建立在假定的正态分布上。(6)应有适当、合理的解释。五、标准物质和质控物的应用[2,12-26]标准物质是临床分子诊断标准化的核心,也就是说,临床检测的某一标本中特定标志物的量值,不管其用什么方法测定,均可以通过统一的标准物质,而得到相近的结果,其量值均可溯源至同一标准,从而具有可比性。标准物质可归类为第一、第二和第三3个等级。一级标准物质数量有限,可使用10至20年,其为冻干品。一级标准可用来校准第二和第三级标准。例如,常规测定中使用的校准物质。国际标准可作为第一级标准物质,一旦第一级标准确定,二级标准可用来维持校准。校准的二级标准可在以国家为基础的范围内供应。目前可得到的国际标准物质中特定分析物的浓度一般以IU/L表示,也可用mol/L和g/L来表示,后者通常是分子结构清楚的物质。在临床测定中所使用的校准品的值,溯源至一级标准的值,通常由下述几个校准步骤组成,即标准品和测定方法、缓冲液及其基质、稀释的控制、最终结果的统计学评价和质量控制等。当建立一个测定方法时,通过上述过程可将一级标准物质的值传递至二级、三级标准品和(或)校准品,使得所建立方法的测定值可溯源至一级标准物质。当引入一批新的试剂时,即需要重复这种传递过程,从而保持校准的可靠性。标准物质定值的测定方法可使用决定性方法、参考方法和确定程序的多中心测定。决定性方法(definitive method)是一个具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。当没有决定性方法可使用时,则可确定一个参考方法。参考方法的变异要大于决定性方法。在蛋白质、核酸和基因检测中,目前很少有参考方法,国际上对标准品的定值通常是遵循一定的程序,采用多个参考实验室联合定值的模式,结果均以IU/L表示,通常是根据一定的统计学方法,以大部分实验室能检出的最低含量定为1 IU/L。质控品则是含量已知的处于与实际标本相同的基质中的特性明确的物质。这种物质通常与其他杂质混在一起,根据其用途可分为室内质控品、室间质评样本和质控血清盘等3类。室内质控品用于临床实验室日常工作的室内质控,其定值应可溯源至二级标准品。室间质评样本则由主持室间质评的机构制备或监制,通常无需准确的定值,但对于定性测定,则需用各种已有的方法,以明确其阴阳性。质控血清盘为经过筛检得到的有明确阴阳性的原血清标本,阳性强弱不一,阴性标本则可能含有对测定会产生非特异干扰的物质,阴阳性血清总数之比通常为1:1,血清盘可用于特定的定性免疫测定试剂盒的质量评价,评价内容包括特异性、敏感性、符合率和对可能存在的非特异干扰物的拮抗能力。目前国际上,可用于临床分子诊断的国际一级标准物质已有很多,如血清蛋白、免疫球蛋白、细胞因子、激素、一些肿瘤标志物〔甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等〕、病毒核酸(HAV、HBV、HCV、HIV-1、HPV B19等)和病原体抗原和抗体(HBsAg、抗HBs)等。这些标准物质均由一些国际标准化组织和机构提供,如英国国家生物学标准和质控物研究所(NIBSC)、美国疾病预防控制中心(CDC)、美国病理学家协会(CAP)的国家委员会、国立卫生研究所(NIH)等。在国内,中国药品生物制品检定所和卫生部临床检验中心则提供一些相应的国家标准物质。六、工作程序、试剂方法、标准物质和实验室结果可比性的关系从图1中可见,在临床分子诊断标准化诸要素中,标准物质是获得具有可比性结果的前提。但光有标准物质还不行,试剂方法和工作程序的标准化,也是不可或缺的要素。标准物质作为核心,其可作为试剂方法和工作程序是否达到标准化的评价“金标准”。试剂生产厂家通过使用标准物质对于许多缺乏参考方法的核酸、基因和蛋白等大分子的测定,使其定量具有溯源性,从而在试剂层面上保证使用不同或相同试剂的临床实验室间结果具有可比性。临床实验室使用标准物质,不但可以在试剂方法使用前,对其测定准确性进行有效的评价,而且,可以充分评价实验室所制定的所有工作程序对保证检验结果准确的有效性。图1. 临床实验室分子诊断技术标准化诸要素间的关系综上所述,标准化是实现临床实验室分子诊断结果可比性的前提,而标准化并非是单一因素,其由诸多关键性环节组成,核心是标准物质的研制及应用。众所周知,一个参考系统是由参考方法、标准物质和参考实验室等三个方面组成的,但临床实验室既不可能在其日常工作中普遍使用参考方法,也不可能都成为参考实验室。唯一可以普遍应用的就是标准物质。标准物质的功能,一是试剂生产厂家在制备试剂盒时,使用标准物质来保证其试剂检测结果的溯源性;二是临床实验室工作人员在实际工作中,使用标准物质来验证试剂方法、工作程序的实际有效性。这些都是保证日常检验结果准确性的必由之路,也是不同实验室间结果走向有条件互认的前提。

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中国黄牛肉用选育的背景

由于社会经济的不断发展和人民生活水平的不断提高及市场的变化,使中国黄牛的选育方向经历了一系列历史性的变化,即“役用-以役用为主-役肉兼用-肉役兼用-肉用”的选育过程。20世纪70年代以前,中国牛业以役用为主,大部分研究主要是集中在牛的营养代谢试验、役用性能、生长发育、生理生化指标测定、冻精制作及种质特性等基础研究工作。20世纪70年代以后,中国黄牛作为农业的动力已退居次要地位,随着中国良种黄牛委员会的成立,一些品种成立了选育协作组,先后制定了选育方案、体型外貌鉴定方法、良种登记和畜群档案制度。在20世纪70年代中期,中国才提出“独立的肉牛业”,但是由于没有根据中国本地黄牛的特点,及时总结世界上肉牛品种利用的历史,先后引进了28个国外肉牛品种进行杂交改良,当前在中国肉牛生产中影响面最大的当数西门塔尔牛,其次为夏洛来和利木赞。从80年代以后逐渐有计划的起步黄牛的肉用选育。

2 中国肉牛分子育种的必要性

作为世界牛品种资源宝库的重要组分,我国黄牛品种资源十分丰富,适应性强,肉质良好。然而,由于历史上以役用为主,我国黄牛作为规模化肉用生产的牛种,缺点也是明显的。这主要表现在后躯不发达,产肉少,育肥增重速度赶不上国外的专门化肉牛品种,加上没有经过系统的肉用性能选育,肉的品质规格往往差异较大,优质高档肉块产量少,造成发展肉牛生产的规模效益比不上专门化的国外肉牛品种。但另一方面,我国各黄牛品种内个体间存在极大的差异,一些个体的生长育肥性能较好。在一些群体中,部分个体具有很好的肉用特征。如果通过品种内高强度的选择和培育,完全有可能在较短时间内培育成为中国特有的优良肉牛品种。据张英汉报道,我国地方黄牛,例如晋南牛、秦川牛中分别有20%~26%和5%~10%的个体具有不亚于国外专门化肉牛品种的肉用体型特点。因此,充分利用这部分牛群,应用现代生物技术迅速培育、发展具有我国本地黄牛优良的肉质特性,且生长速度快、屠宰率和净肉率较高的新型肉牛品种(系),建立现代的中国种(肉)牛业是发展我国肉牛业的重要战略目标,也是中国面对国外肉用种牛和牛肉产品挑战的唯一选择。

肉用性状是典型的、具有重要经济价值的数量性状,受环境因素影响较大,用常规育种方法进行育种进展缓慢。20世纪80年代后期以来,国际上的动物遗传育种已经进入分子水平,即分子育种,使育种朝着快速改变动物基因型的方向发展。近几年来,由于分子生物学和各种分子生物技术的发展,使人们有可能直接从遗传物质本身的基础上揭示生物的性状特征,它与基因产物的研究相比克服了年龄、性别、组织及各种内外环境因素的影响,而且所提供的遗传差异,即遗传标记的种类又非常多,因此,分子育种越来越受到人们的重视。进入20世纪90年代中期以后,在我国逐渐开展了黄牛肉用性能的分子遗传学研究。采用基因标记等现代分子育种新技术结合常规育种,以便能够加快中国肉牛品种的培育和和选育。然而从总体上来看,目前大部分黄牛品种的繁育盲目性还是太大,远没有建立起完整意义上的现代肉牛纯种繁育体系和杂交繁育体系,欲改变这种现状,将是今后10~20年内中国养牛学界所肩负艰巨历史使命之一。

3 分子育种研究的内容和特点

动物分子育种(animal molecular breeding)是利用分子数量遗传学理论和技术来改良畜禽品种的一门新兴学科,是传统的动物育种理论和方法的新发展。从目前发展现状来看,它应包括两方面内容:基因组育种(genomic breeding)和转基因育种(transgenic breeding)。其中,基因组育种是在比较基因组研究和基因组分析的基础上,通过DNA标记技术来对畜禽数量性状座位进行直接选择,或通过标记辅助导入有利基因,通过标记辅助淘汰(marker assisted culling,MAC)清除不利基因等,以达到更有效地改良畜禽的目的。转基因育种则是通过基因转移技术将外源基因导入某种动物的基因组上,育成转基因畜禽新品种(系),从而达到改良重要生产性状(如生长率、遗传抗性等)或非常规性育种性状(如生产人类药用蛋白、工业用酶等)的目标。

由于动物分子育种是直接在DNA水平上对性状的基因型或基因进行选择,因此其选种的准确性大大提高,克服了传统动物育种方法的缺陷。按照常规育种方法要提高家畜的生产性能,如瘦肉率、产奶量、增重速度、饲料利用率等,人们往往需要进行多代杂交,选优交配,最后培育出高产、优质的品种。然而,这种传统的方法存在着品种育成时间长、育成后再想引入新的遗传性状困难大等许多弊端,使带有新性状的品种可能同时也携带有害基因,杂交后有可能会降低原有性状。而分子育种能够克服传统杂交选择法的各种缺陷,具有高效、快速育种的特点,目前已显示出了越来越强大的生命力,必将成为动物遗传育种学科发展的方向和21世纪动物育种的主流。

4 中国黄牛分子育种研究进展

中国黄牛(肉牛)分子育种的研究主要集中在肉用性状。自从中国黄牛开展了分子遗传学研究以来,研究的内容已涉及到功能基因的编码序列和非编码序列。研究的功能基因已超过40个,这些基因主要包括与中国黄牛生长发育性状、屠宰性状、肉品质性状、繁殖性状、抗病性状相关的基因,非编码基因包括微卫星DNA序列和mtDNA的D-Loop序列。研究的主要目的一是揭示生产性状的分子遗传标记,直接用于选种;二是揭示品种的分子群体遗传学特征,阐明品种间的差异和遗传关系,用于杂交效果的预测、遗传资源的评价、保护和开发利用。目前中国黄牛大部分品种或多或少都进行过分子遗传学方面的研究,但做的工作比较多的品种主要集中在中国几个优良黄牛品种上,包括秦川牛、南阳牛、鲁西牛、晋南牛、延边牛、郏县红牛和培育品种中国西门塔尔牛、草原红牛以及引进品种如利木赞、德国黄牛、红安格斯牛的杂交系。

4.1功能基因多态与生产性状关联研究

4.1.1 生长发育相关基因的研究。关于中国肉牛生长发育候选基因研究较多,涉及GH、GHRH、GHR、POU1F1、IGFBP-3、IGF-1、IGF-2、MEF2、TG、MC3R、MC4R、AGRP、NPY、POMC、CART、Ghrelin、Hcrtr1、Orexin、HTR1B、HTR2A、CLPG等21个功能基因。研究主要集中在秦川牛、南阳牛、鲁西牛、晋南牛和郏县红牛等重要地方黄牛品种上。

秦川牛、鲁西牛、南阳牛和中国西门塔尔牛GH基因第5外显子位点突变等位基因B为体重、体高、体斜长、胸围的正效应等位基因。南阳牛IGF2基因BB基因型初生重、体重、胸围显著大于AA型。秦川牛生长激素受体基因的AB基因型效应在部分生长性状上高于其他基因型。南阳牛、秦川牛及杂种牛秦安、秦德、秦利4个群体内POU1F1基因AB、BB基因型个体在胸围,十字部高指标上显著高于群体AA型个体,即BB、AB>AA,可作为秦川牛体尺指标(胸围、十字部高)候选基因之一。晋南牛IGFBP-3基因AA型后腿宽显著高于AB型。CLPG基因AC基因型的体重和体长显著大于AA、AB型。秦川牛AGRP基因群体中BB基因型个体体重、体高显著大于AA型个体。南阳牛POMC基因BB型6月龄体重和0~6月龄平均日增重显著大于AA型。南阳牛DGAT2基因基因型AB的6月龄体重比基因型AA高6.7%;6月龄体高比基因型AC高3.2 %,基因型B 12月龄的坐骨端宽比基因型AA高3.3 %,基因型AB 24月龄胸围比基因型A高3.1%。MC4R基因与牛体重和初生重存在相关。

4.1.2 屠宰性状相关基因。 关于屠宰性状相关基因研究相对较少,由于屠宰性状的样本资料获得相对较难,对屠宰性状遗传标记的研究受到一定的限制。现共涉及IGFBP-3、DGAT1、DGAT2、MSTN、Myf-5、Myf-6、MyoD、MyoG基因等8个以上的功能基因。

IGFBP3基因与秦川牛、南阳牛屠宰率和净肉率存在相关。鲁西牛DGAT1基因KK型腔油重/胴体重明显高于AA型,而且KK型个体有更高的净肉率。鲁西牛DGAT2基因AA型个体的屠宰率显著高于AB和BB型。Myf5基因在南阳牛群体中,18月龄南阳牛AA型个体则极显著高于AB和BB型个体;在秦川牛群体中,AA型个体的体高和十字部高显著低于AB和BB型个体;郏县红牛AA型个体的坐骨端宽显著高于其它两种基因型个体。关于秦川牛、南阳牛、蒙古牛和西门塔尔牛MSTN基因序列特征和多态性均有报道。王珊等(2006)报道了牛MyoG基因的序列特征。

4.1.3 肉品质性状相关基因。肉品质相关基因研究涉及Leptin、CAST、CAPN 1、CAPN 4、UCP3、H-FABP基因等6个功能基因。牛CAST基因中的B等位基因,尤其是BB纯合基因型对牛肉嫩度具有显著影响,并且在利木赞品种内达到极显著。CAPNI基因A3717G位点上,AG基因型和GG基因型的嫩度值好于AA基因型的嫩度值;在A3854G位点上,GG基因型的嫩度值好于AA基因型的嫩度值。李武峰(2002)和李君灵(2006)利用PCR-RFLP技术研究牛小亚基钙蛋白酶(CAPN4)基因第5内含子的遗传变异,共发现了5个SNP,但对肉质无影响。H-FABP基因中h等位基因,尤其是hh纯合基因型对牛肉WBS值有较大的影响;鲁西黄牛BB纯合基因型对牛肉嫩度剪切力值有较大的影响。IGFBP3基因AA 型个体的眼肌面积大于BB 型个体(P<0.05),AB型和BB 型个体胴体脂肪含量高于AA 型个体。牛DGAT1基因KK型和KA个体外脊肌肉剪切力低于AA型个体。

4.1.4 繁殖性状相关基因。关于繁殖相关基因研究很少。在中国黄牛繁殖性状的研究中,目前主要是针对牛的双胎性展了一些研究,涉及的品种有秦川牛、中国荷斯坦牛、鲁西牛、晋南牛、南阳牛、延边牛等。FSHR基因第一外显子Taq I酶切位点出现多态,并与牛的繁殖性状存在相关。鲁西牛GDF9基因的3’UTR发现缺失突变,发现该多态位点与单、双胎性状之间基因型分布存在显著差异,双胎牛群体B等位基因频率显著大于单胎牛。在国外关于精液中的一些蛋白质研究已有相关报道,并发现一些蛋白与受精过程密切相关,从而选择公牛,提高公牛的繁殖率。

4.1.5抗病性相关基因。关于抗病相关基因的研究主要集中在MHC基因家族,另外还有自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因(nramp1)、白细胞介素IL-8受体基因(cxcr1)、TOLL样受体4基因(tlr4)、乳铁蛋白基因(lf) 和一些易感染病菌过程中的受体蛋白基因及一些突变的正常基因。在中国黄牛上相关的研究不是太多。MHC基因家族在中国黄牛中具有丰富的多态性。在中国荷斯坦牛中,人们将这种多态性与牛的乳房炎相关性状进行了关联分析,获得了一些抗性的基因类型。在中国地方黄牛中,许多抗性基因的研究主要集中在多态性方面,其主要原因是没有找到合适反映中国黄牛抗病的指标体系。孙东晓(2001)报道了蒙古牛MHC-DRB和DQB基因外显子2的多态性,结果表明蒙古牛BoLA-DRB的第二外显子的第70、182位的碱基以及DQB基因的第二外显子的第24、38、74、108、122、138、177位的碱基出现多态。王爱勤等(2005)在鲁西黄牛、渤海黑牛群体中,陈智华等(2007)在大额牛群体中发现相似规律。王兴平等(2006)利用PCR-RFLP技术在鲁西牛、秦川牛、晋南牛和南阳牛群体中新发现DRB3基因第2外显子的第154位C>A突变。但没有与抗病性状相关的报道。

4.2 基因的克隆与功能分析在中国黄牛上,一些基础研究也在不断深入,特别是对一些重要功能基因的分子遗传特征、功能和表达研究。Zhang et al. (2007)首次报道了对采食有重要调控作用的HCRTR1基因的遗传变异,发现了新的SNP位点。甘海云等(2007)克隆测序了中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和渤海黑牛三个品种的MC1R基因,新发现了1个SNP。张林等(2006)成功地克隆到了牛IL-18全基因,与GeneBank所登录的牛IL—l8核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99.5%和99.0%。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84.9%~99.5%和74.9%~99%。张辉等(2006)从脂肪组织总RNA中扩增得到ADPN基因的501 bp片段,其cDNA序列与GenBank牛ADPN基因序列同源性为85%,其氨基酸同源性为96%。王峰等(2005)首次获得了牛BMP4基因的部分外显子序列,并与羊、人、小鼠、大鼠等动物的BMP4基因序列进行了同源比对。马云等(2006)克隆了牛FABGL基因的cDNA进行了序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。张春雷等(2007)对牛性情调控的基因分子遗传基础进行了探索。在秦川牛上,已对Ghrelin基因、NPY基因全序列进行了克隆,并成功地在原核生物中得到表达)。总之,这方面的研究多集中在基因部分片段上,缺少全面性,研究的不够深入,特别在功能和表达分析方面相关报道还很少。

4.3 生产性能的微卫星标记研究微卫星DNA多态性较多,在中国黄牛上的研究涉及到BM1500、BM1824、BM2113、BM315(215)、CSSM66、ETH152、ETH185、ETH225、HEL1、HEL13、HEL5、HEL9、ETHl0、INRA005、TGLA126、TGLA227、IDVGA2、IDVGA3、IDVGA27、IDVGA44、IDVCA46、oarHH55、TGLA126等23个位点,但这些研究主要用于分析牛的亲缘关系和起源进化,与生产性状相关分析研究相对较少。

BM1824位点基因型与肉牛的生长、产肉以及双胎性状均存在相关。BM2113位点的142-/144-/158-基因型对秦川牛的体长、体高、胸围、腰角宽、尻长有显著的标记效应,而对于秦川牛的体躯指数的标记效应达到极显著。CSSM66位点的181-/183-基因型对秦川牛的尻长影响达到显著,对体躯指数的影响达到极显著。ETH225位点与秦川牛及其杂交群体的生长性状存在相关。HEL13位点在双胎牛中比单胎牛缺一条230 bp的等位基因, INRA005位点在双胎牛中比单胎牛缺一条217bp的等位基因。秦川牛IDVGA-3位点163-183基因型个体的眼肌面积显著高于163-163型个体。草原红牛IDVGA46等位基因D(211 bp)对3个肌肉度评分性状肩部、腰厚、大腿肌有负相关;等位基因B(205 bp)在腰厚方面有正相关。

4.4 黄牛比较基因组研究与分子进化对于中国黄牛遗传资源方面的研究主要集中在中国黄牛的起源进化和亲缘关系研究,这方面的研究国际上一直很重视。在中国,黄牛品种间的亲缘关系和起源进化研究进展最快,研究方法已从蛋白质多型性分析,转变为核DNA和线粒体DNA序列特征分析。线粒体DNA D-loop的多态性研究发现中国黄牛有普通牛与瘤牛两大起源,其中普通牛单倍型又可分为4个支系(T1~T4),其遗传多样性丰富,首次发现中国黄牛中有非洲牛支系T1,占1.03%。中国瘤牛也有两个支系I1和I2,但其遗传多样性十分贫乏。对mtDNA Cyt b 基因进行了测序分析,界定了47个单倍型,105个多态位点,证实中国黄牛有普通牛与瘤牛两大母系起源。从分子水平证明西藏黄牛是普通牛和瘤牛的混合起源,并且发现中国黄牛中普通牛与瘤牛类型的分布是有特点的,在北方黄牛中,只存在普通牛类型,在中原黄牛与南方黄牛中,绝大部分都是普通牛与瘤牛的混合类型,只有雷琼牛是瘤牛类型。从Y染色体微卫星位点证实普通牛和瘤牛两种起源在中国黄牛不同品种中的分布频率有明显差异。普通牛类型从南向北逐渐增加,瘤牛类型从南向北逐渐减少。中原黄牛群受两种类型牛影响因品种不同而差异很大。发现中国和东南亚沼泽型水牛有两个mtDNA支系A和B,并初步证明亚洲沼泽型水牛(中国水牛)是在中国独立驯化的。

5 中国肉牛分子育种存在的问题

中国黄牛分子育种研究方面已取得很大进展,已获得了许多关于中国黄牛分子遗传特征的信息,也发现了一些与生产性状有关联的基因和基因类型,这些为今后对中国黄牛的进一步研究和在分子育种方面的应用奠定了良好的基础。但是,中国黄牛分子育种研究目前还存在一些问题。

5.1分子育种研究系统性不够我国肉牛分子育种起步较晚,但研究进展较快。然而,许多研究比较零散,不够系统、深入。主要表现在:①许多研究只涉及基因的部分片段,全基因序列研究的不多。②基因的功能研究涉及的较少,也比较肤浅;③功能基因表达调控分析方面的研究还不多;④在中国地方黄牛上转基因研究似乎还尚未开展。

5.2研究经费不足分子育种研究,需要投入大量的人力、物力和资金。在中国黄牛上,我国对于这方面的研究投入力度较小,迄今中国肉牛分子育种方面的研究开展的还不够深入。由于研究经费有限,研究工作只能零敲碎打,检测的手段也比较落后。在发达国家已将基因芯片技术应用于分子育种研究,开展重要功能基因的筛选、鉴定和SNP检测,目前已开发出许多基因试剂盒用于辅助选择。

5.3样本量较少在遗传标记的分析中样本量是很关键的,虽然目前对样本量没有严格的要求。但样本量越大越准确是无疑的。在我国由于尚无较大的、规模化的中国黄牛育种场,样本量的获得受到了限制。所以,国内肉牛研究的样本量一般较小,早期研究的样本量才只有十几头,从而影响了研究结果的可性靠。

5.4 研究群体的稳定性差在我国,一些肉牛分子育种研究尚无固定的试验群体,有些是用农民饲养的黄牛个体及资料,个体流动性较大,追踪验证困难,一些表现优秀的个体,过段时间往往被卖掉。所以,开展分子育种必须建立稳定的育种核心群体。

6 中国肉牛分子育种的思路和展望

6.1 中国肉牛分子育种的思路

6.1.1 中国肉牛分子育种今后研究的重点目前牛基因组草图已完成,牛基因图谱的饱和度大幅度提高。所以今后中国黄牛分子育种研究的重点主要应放在分析控制肉牛重要经济性状功能基因座位的数量及对相应表型的影响;寻找和扩大遗传多态标记的数量和在基因组中的定位;基因功能的鉴定和相互作用及其调控网络关系分析;用MAS技术来实现提高肉牛育种项目遗传进展速度和效益;基因组数据库系统和实验信息及资源共享体系的建立与完善,以及基因转移技术在中国黄牛肉用选育中的应用研究等。

6.1.2建立健全肉牛育种场(企业)的技术档案体系为了提高分子育种技术的准确性,相应的技术资料是非常重要的,所以,不但需要建立稳定的育种核心群体,还需要建立健全肉牛育种场(企业)的技术档案,以便提高分子育种的可靠性和准确性。

6.1.3应加强中国肉牛分子育种研究的投入为了加快中国肉牛分子育种研究的开展,国家、地方应加大投资力度,并调动各方面的积极性,鼓励相关企业积极参与和投资,早日培育出中国特色的肉牛新品种(系)。

6.1.4分子育种与其他生物技术相结合在培育中国特色肉牛新品种中,除了采用分子育种技术外,还应转基因技术,胚胎生物工程技术紧密结合,加快优良个体的扩繁。

6.1.5应将分子育种与常规育种技术紧密结合在分子育种过程中,分子育种不能代替常规育种技术,常规肉牛育种技术和现代分子育种技术两者的有效结合,是未来中国肉牛育种的行之有效的根本措施。

6.2中国肉牛分子育种的展望综上所述,中国的肉牛分子辅助选择技术研究已取得重要进展,发现了一批具有应用前景的遗传标记。目前,尽管在肉牛分子育种研究中还存在一些需要改进的地方,但肉牛分子育种研究的势头很好,仍处于快速发展时期,随着研究的不断深入和研究成果的不断积累,肉牛的分子育种实践的到来会为时不远,由于它能够使选种的准确性提高,大大加快肉牛肉用性能的选育,无疑将成为未来肉牛新品种培育和品种改良的主要工具。

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