数字 PCR( Digital PCR，dPCR)是继实时荧光定量 PCR( Real-time quantitative PCR，qPCR) 之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行 PCR 扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统 PCR 技术相比，数字 PCR 技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。近年来，随着微流控技术日臻成熟，基于微流控技术的数字 PCR 技术得到了快速的发展，在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。

数字PCR( DigitalPCR，dPCR) 是 20 世纪 90 年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR 扩增与计数式检测，相较于PCR 技术，能够直接计数 DNA 分子的个数，可实现样品的绝对定量分析。数字PCR 过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下，使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中，每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个 DNA 模板分子，模板分子的分散符合泊松分布。PCR 扩增结束后有荧光信号单元记为 1，无荧光信号则记为 0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出DNA 模板分子的起始浓度，原理如图所示。

理想情况下，当待测样品的 DNA 浓度被稀释到很低水平时，样品溶液被分散到大量的反应单元中，使每个反应单元所含有的 DNA 分子数最多只有一个，这种条件下，可通过对阳性反应单元的数目进行统计，直接确定DNA 模板分子的起始数目。但当测定高浓度模板时，部分反应单元中含有两个或两个以上 DNA 分子，大量 DNA 模板分子的随机分布情况符合泊松分布。因此，DNA 模板分子的绝对浓度可以采用泊松分布概率公式计算。

式(1) 中，λ 是 DNA 模板分子在每个反应单元中的平均拷贝数，p 是反应单元中含有 k 拷贝 DNA 模板分子的概率。λ 相当于样品中 DNA 模板分子的起始拷贝数(c) 稀释了 m 倍(m 为稀释倍数，相当于独立反应单元的体积) ，λ = cm；当 k = 0 时，即反应单元中没有 DNA 模板分子的情况，式(1) 可简化为：

同时，当 k = 0 时，其概率 p(x = 0) 相当于无DNA 模板分子的反应单元数与总的反应单元的比值，即：

式(3) 中，n 是反应单元总数，f 是阳性反应单元数。将式(3) 两边同时取对数即得到：

因此，采用数字PCR 技术进行核酸定量分析时，在已知反应单元总数、稀释倍数以及阳性反应单元数目的条件下，可得到样品中 DNA 模板分子的起始拷贝数。在数字PCR 技术中，待测物原始浓度的定量既不依赖于校准物的标准曲线，也不受扩增效率的影响，避免了由于样品与校准物扩增效率的不同而导致的结果不确定性与不准确性。与PCR技术相比，其定量结果具有更高的准确性和灵敏度。 

第一代PCR技术在扩增后，通过凝胶电泳进行分析，仅可获得定性结果。直到20世纪90年代，伴随着生物荧光技术的发展，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)应运而生，并成为核酸定量检测的主流技术，沿用至今。由于qPCR为大体积反应系统，存在较多的背景干扰，无法获得绝对定量结果，随着检测要求的提高，qPCR逐渐无法满足临床一些超高灵敏度、精密度的检测要求。

至20世纪末，Bert Vogelstein 等首次提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，文章正式报道于美国科学院院刊PNAS，并表明该技术可用于发现罕见的癌症突变。2003年，Kinzler和Vogelstein继续完善dPCR，并创建了一种改进的方法，他们将其称为BEAMing技术，即“珠子，乳状液，扩增和磁性”的首字母缩写。BEAMing技术使用乳状液在单个试管中分隔扩增反应。这一变化能在一次运行中将该PCR扩展到成千上万的反应。自此，关于dPCR两种形式（芯片式和液滴式）的基本方法都已经建立，企业界的大佬也正式开启了dPCR的商业化进程。发展到现在，市面上常见的dPCR主要有两种：微滴式dPCR（dropletdPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技术。由于芯片式dPCR制造芯片的成本较高，目前微滴式dPCR正越来越受到企业的认可。

ddPCR主要有Bio-rad公司开发的QX200系统和RainDrop系统，QX200可以将体系分割成2万个微滴，Rain Drop可以分割成100万-1000万个微滴。通过将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，利用微滴发生器制成近20000个油包水小微滴从而对原始体系进行分割，样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。

3 .1 绝对定量

常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而ddPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行绝对定量。

3.2 样品需求量低

在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。

3.3 高灵敏度

ddPCR本质上是将一个传统的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，在这些反应中可以精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品，且能避免非同源异质双链的形成。

3.4 高耐受性

由于目的序列被分配到多个微滴中，显著降低了体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。尽管dPCR被称作第三代PCR技术，但是客观地来看，dPCR技术逐渐显现出一些不足之处。通量不高、操作复杂，同时成本大大增加，dPCR似乎还没有找到相对qPCR足够的不可取代性优势。另一方面，dPCR增加了很多技术难点，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR扩增，如何进行灵敏的信号检测和分析，如何提高自动化程度，实现Sample-In Result-Out。相较于Digital ELISA能够提高免疫检测的灵敏度到fg/mL级别，实现了高敏蛋白的检测，dPCR尽管发展更早，却难以取得Killer Application，或许这也导致了所谓的第三代PCR在很多人看来却没那么“下一代”。

4.1 在突变检测方面的应用

常规组织和血液等样品中，由于单个突变的体细胞含量低，使得检出其存在变得困难。而 dPCR 可对复杂的大背景进行有限的稀释或分区，通过有限稀释，降低野生基因型的背景信号，使得低丰度的目的序列能够被灵敏的检出，特别适用于稀有突变的检测应用。研究表明，低至 1/100000 的变异频率能被检测出来。并且随着反应室数量的增加，对稀有变异的分析更灵敏。 

4.2 在拷贝数变异检测方面的应用

通常基因表达分析依赖于琼脂糖凝胶电泳、realtime PCR 等方法，拷贝数的确定总是受到限制。而使用 dPCR 进行直接计数目标基因和参照基因的双重反应，通过计算比值，便可直接得到目标基因的拷贝数。

  4.3 在微生物检测方面的应用

核酸扩增技术是病原微生物检测的一个重要方法，但可能存在的问题是，有时候低水平目标分子和小分子抑制剂的存在使得检测定量的结果发生偏移。dPCR 则是一种不需要标准曲线并且对部分抑制剂不灵敏的检出方法。因此，研究人员纷纷将其应用于一些病毒或致病菌的检测研究中，如 HBV、肠病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分支杆菌、产志贺毒素大肠杆菌等。 

4.4 在转基因食品检测方面的应用

欧盟国家对转基因食品有着严格的限定，而目前，一般采用实时定量 PCR 用于商品中转基因的分子定量分析。但是在一些复杂的食物原料和饲料原材料中，目标DNA非常少，使得对其的检测和定量受到限制。dPCR 为国内外研究人员提供了新的方法。Morisset等用ddPCR对 MON810  转基因和 hmg  玉米参考基因进行绝对定量。研究表明，ddPCR 对低浓度的检测具有更高的重复性，并且对抑制剂具有更高耐受性。Dobnik 等用多重 ddPCR 检测定量 12 个欧盟授权转基因玉米，对于含转基因组织样品中，该方法比实时定量 PCR 更高通量、更高效。

4.5 在下一代测序方面的应用

dPCR平台可以与 NGS 对接，实现对测序文库的质量控制、提供对测序文库的定量分析和质量评估信息。一方面，dPCR 对 NGS 的测序结果进行验证，对诸如单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包含反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段、过长连接片段等，这是当前其他方法所不具备的优势。Alikian 等研究表明，在慢性粒细胞白血病患者的检测中，dPCR 比 qPCR 更准确，定量分析结果可靠性高、重复性好。  目前，市场上已有多款商业化的数字PCR 仪器出现，对进一步拓展和深化数字PCR 技术的应用具有积极的促进作用。未来如果能有效解决 dPCR 耗材成本高、实验通量少等问题和实现操作智能化，dPCR 将在临床诊断与治疗、微生物检测和食品安全检测等方面拥有更广阔的应用前景。

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qPCR检测，你需要知道这些

数字PCR是一种DNA绝对定量技术。当前DNA定量有三种，光度法基于DNA分子的吸光度来定量；实时荧光定量也就是real time-PCR基于Ct值，也就是可以检测到荧光值对应的循环数定量；数字PCR是最新的定量技术，他基于单分子PCR方法来采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度。

数字PCR介绍

生物学划分为两个时代：PCR前时代和PCR后时代，这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技术的构想， 1985年，他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K. Saiki领衔发表，1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶，并将其应用于PCR反应，使PCR变得更加简单、易行和稳定，随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度，大致经历了以下三个阶段：（I）终点PCR：定性分析（II）定量PCR：相对定量（III）数字PCR：绝对定量

早期PCR主要用于定性分析，根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否，这种PCR可以称为终点PCR，在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年，Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定，这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下，这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR，那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年，罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文，介绍了将溴化乙锭（EB）用于PCR产物动态监控的方法，这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年，ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年，Wittwer等比较了（i）基于双链特异性染料SYBR Green I（ii）基于5’-核酸酶和双标探针（iii）基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般，人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量，不过本质上来说，qPCR只能用于相对定量，绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，产物浓度与起始浓度存在如下关系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始浓度，N T 代表终点浓度，n代表循环数），对公式两边取以对数可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常数e为底的对数），如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即qPCR中的荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系，这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素：（1）人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号，于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪；（2）不同的靶标基因的扩增效率不同，因此无法直接比较，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念），它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中，他们通过将DNA分子稀释到单拷贝，然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律，计算了靶标基因的分子数目，不过他们没有进一步发展该技术，很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制，另一方面受到检测仪器的限制，直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理；2001年，Livak KJ等介绍了2 - ∆∆ Ct 法的推导过程，局限性及应用。

当然这些原理很简单，即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增，当我们把终点的判断标准固定时，起始模板量高的样本最先到达，起始模板量低的样本消耗更多的循环数，并且每相差一个循环，代表起始浓度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。检测不同样本时， ∆ Ct可能受样本量差异的影响，因此引入了内参基因的校正。内参基因，也叫管家基因或者看家基因，一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达，那么两个样本内参基因的 ∆ Ct就代表了样本量的差异，靶标基因的 ∆ Ct – 内参基因的 ∆ Ct即为靶标基因的真实表达量差异，这就是2 - ∆∆ Ct 法。

但是有几个问题需要注意：（1）PCR并非全程都是指数增长期，比较必须在对数扩增期进行（2）一般默认对数增长期扩增效率是100%，这并不严谨，尤其是一些扩增困难的模板，效率可能与100%差异很大，纵向分析某基因的表达量（如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量）时，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能并不太准确（3）不同靶标基因的扩增效率是不同的，因此横向比较不同靶标基因时，可能造成较大的误差。

鉴于此，我们在设计引物时，应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近，从而保证相近的扩增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站，收录了大量物种的qPCR引物数据，具有一定参考价值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等对2 - ∆∆ Ct 法进行了一些校正，采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正，具有一定参考意义。

qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。（2）Simmonds等报道的方法，将DNA模板做极限稀释，一直到PCR体系中仅含有一个模板分子，此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型，在实际操作中很有困难，首先需要很多稀释梯度，其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数，如RNA分子数的精确测定，DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数，该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数，结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性，因此，他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。

拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品，质粒容易提取和纯化，因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度，精确测定其核酸浓度，根据公式：N = 6.02 × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数，式中N代表分子数目，M DNA 代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因，按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数，然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数，带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般，应该选择基因组上拷贝数较低，物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式，双标准曲线并不是必需的，如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法测量靶标基因的拷贝数，林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法，其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确，并且能够发现新基因型，是基因分型或SNP检测的金标准，但它比较慢，且操作比较繁琐。qPCR检测操作简单且速度极快，目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年，Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因，这种方法容易理解，假设已知SNP位点为A/T，如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型，3’-T引物产生终点信号为T基因型，两种引物均产生信号即为杂合型。1995年，Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法，这种方法中，分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针，并设置纯和基因型的对照，随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型，靠近B参照代表B基因型，如果位于A和B之间则为杂合型（如下图）。

2003年，Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法，这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物，A基因型设计正常长度的引物，B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，经过PCR扩增后，不同基因型产物的Tm就会发生变化，依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线，可以快速区分基因型。

1995年以后，qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长，成为分子生物学最热门的领域之一。近年来，随着分子诊断行业的崛起，qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时，也产生了一些问题，如判断标准不一致，检测精确度没有统一标准，RNA检测假阳性较严重等。2009年，多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的 MIQE指南 ，该指南规范了qPCR的常用术语，如Ct应称为Cq，RT-PCR应写作RT-qPCR等，并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求，此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成，共85个参数，以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份，但遵守这些规范能够让你的研究更易重复，也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注：指南的内容和附表可以在这里获取： http://rdml.org/miqe.html

参考文献

[1] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985230(4732):1350‐1354. doi:10.1126/science.2999980

[2] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988239(4839):487‐491. doi:10.1126/science.2448875

[3] Simmonds P, Balfe P, Peutherer JF, et al. Human immunodeficiency virus-infected individuals contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low copy numbers. J Virol. 199064(2):864‐872.

[4] Simmonds P, Zhang LQ, Watson HG, et al. Hepatitis C quantification and sequencing in blood products, haemophiliacs, and drug users. Lancet. 1990336(8729):1469‐1472. doi:10.1016/0140-6736(90)93179-s

[5] Higuchi, R et al. “Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.” Bio/technology (Nature Publishing Company) vol. 10,4 (1992): 413-7. doi:10.1038/nbt0492-413

[6] Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, et al. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques. 199722(1):176‐181. doi:10.2144/97221pf02

[7] Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acids Res. 199321(8):2017‐2018. doi:10.1093/nar/21.8.2017

[8] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 200125(4):402‐408. doi:10.1006/meth.2001.1262

[9] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 200129(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45

[10] Rao X, Huang X, Zhou Z, Lin X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 20133(3):71‐85.

[11] Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, Bunn HF. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 199087(7):2725‐2729. doi:10.1073/pnas.87.7.2725

[12] Song P, Cai C, Skokut M, et al. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERS™-derived transgenic maize[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20(10): 948-954. doi: 10.1007/s00299-001-0432-x

[13] 林维石等：利用实时荧光定量比较Ct法检测转基因小鼠外源基因拷贝数[J]. 生物技术通讯, 2013, 4(24): 497-500. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.012

[14] Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 198986(8):2757‐2760. doi:10.1073/pnas.86.8.2757

[15] Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 198917(7):2503‐2516. doi:10.1093/nar/17.7.2503

[16] Huang MM, Arnheim N, Goodman MF. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 199220(17):4567‐4573. doi:10.1093/nar/20.17.4567

[17] Livak KJ, Marmaro J, Todd JA. Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nat Genet. 19959(4):341‐342. doi:10.1038/ng0495-341

[18] Landegren U, Nilsson M, Kwok P Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis[J]. Genome research, 1998, 8(8): 769-776. doi:10.1101/gr.8.8.769

[19] Papp AC, Pinsonneault JK, Cooke G, Sadée W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 200334(5):1068‐1072. doi:10.2144/03345dd03

数字PCR（二）— Bio-rad ddPCR

数字PCR系统作为一种常用且有效的生命科学研究工具被广泛接受并开始进军临床市场。法国Stilla Technologies公司发布高通量数字PCR系统-Naica HT，配合新型的Opal芯片，较Naica数字PCR系统的通量有效提高四倍。

此外，该公司发布6色数字PCR检测系统的开发项目，增强系统的检测能力，并寻求与诊断领域和诊断试剂制造商的合作机会。

Stilla公司商业运作副总裁Caroline Charky在2019年2月的SLAS大会（Laboratory Automation and Screening Conference）会议上发布高通量数字PCR系统Naica HT和新型的Opal芯片，每天能检测≥240个样本，并在这次会议上获得了NPA新产品大奖。

Charky介绍道“Opal芯片采用了与第一代Naica系统相同的微流控技术，在芯片内部生成微滴。高通量Naica HT平台和Opal芯片与第一代Naica系统相比，提高了样本容量，并且在价格方面更有竞争力。”

Naica数字PCR系统由三部分组成：Geode装置包括自动化的微滴生成和PCR扩增步骤，在自组装的微滴阵列上进行PCR扩增大约需要1小时。Prime3微滴阅读分析系统，可以读取三色荧光，10分钟可以读取12个样本。Crystal Miner数据分析，能够自动识别三色荧光中每个阴阳性微滴，最终计算出目的DNA的绝对含量。

“Naica 数字PCR系统使用的Sapphire芯片是第一代芯片，能够运行4个样本，每次可运行3张芯片，每天可以做≥60个样本。然而，在欧洲，亚洲，美国很多客户有高通量的需求，现在配合Naica HT高通量数字PCR系统，在与Sapphire同样大小的Opal芯片上可以同时进行16个样本，一次反应可以运行48个样本。”Charky说。

Stilla公司进行市场调研时，发现某些实验室特别是食品检测，肿瘤领域的应用中，如肿瘤病人的伴随诊断和用药监控以及需要数字PCR对阴性结果验证的大型qPCR实验室，都有高通量的需求。

Naica HT高通量数字PCR系统也能够进行三色多重反应，每次实验时间2.5小时，每天可以做五轮实验，Charky说道：“Naica HT高通量数字PCR系统每天可以做240个样本检测，也就是可以进行720个目的基因的检测。”

与Sapphire芯片相比Opal芯片反应体积更小。

“在Opal芯片中我们将反应体积从25μL降到了8μL。”Charky说。“你可以用更少的试剂”她说，对于要求更高灵敏度的实验，Opal芯片有一个集合两到三个密闭反应孔的策略，在95%的置信区间，灵敏度可达0.2copies/25μL。高通量Naica HT数字PCR系统兼容Sapphire芯片和Opal芯片。Naica数字PCR系统可以通过升级到高通量Naica HT数字PCR系统。

雅培实验室的快速诊断部门高级科学家Aric Joneja正在使用Stilla公司的Naica数字PCR系统进行产品研发。他们两年前购买了Naica数字PCR系统用于微滴PCR和微滴RT-PCR。他们计划开始使用Naica HT和Opal芯片。Joneja认为Naica系统人工操作少，耗材少并且操作简便。同时指出，Stilla具有数据回溯查看功能，很容易进行数据质控，查看数据原始结果。Joneja指出实验室肯定不会已经发现了三色检测系统还买两色检测系统。

在后续的访谈中Charky指出Stilla的专利完全不同于Bio-Rad。“每一个部分都是不同的，”她说，“是完全不同的技术。”

同时，Stilla公司正在开发六色检测的数字PCR系统，进行多重目标基因的数字PCR检测，“我们是全球第一家开发六色数字PCR系统的公司”Charky说。

正如之前的报道，2017年发表了用三色数字PCR检测EGFR突变，本月在O ncotarget杂志上发表了使用六色数字PCR检测非小细胞肺癌相关的突变，特别是EGFR基因的致敏和耐药突变的液态活检方法。

“六色数字PCR系统目前还在测试阶段，Stilla预计在2020或2021年发布，”Charky说,“我们公司作为仪器厂商，正在与用Naica开发和优化试剂的公司共同开发试剂，”Charky说,“一家使用Naica系统的德国研发公司，正在开发一种转基因生物的数字PCR检测方法，Stilla计划与这家公司合作推出完整的解决方案，另一家位于蒙彼利埃的公司正在开发用于CE-IVD的CTC、液体活检试剂盒。同时公司也自行开发临床项目，”Charky说,“已经有研发项目的产品能够最终获得CE-IVD。”

自从2016年发布Naica系统，公司已经历3年时间，Charky说,最近获得了illumina的融资。同时也是欧盟与皇家飞利浦主导的“改善癌症护理的液体活检和成像即LIMA”项目的合作方。

去年Stilla获得了巴黎39家医院联盟的公开招标，这39家医院将在接下来四年内完成Naica系统的采购。为了支持企业快速发展，公司正在扩大，在今年底将扩大三倍面积，Charky说。

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数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变

A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表

A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。

理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%<5%的样本含量范围。对于任何dPCR平台，最佳样本浓度都是λ=0.16时对应的浓度，这个时候CV%是最小的（~1.5%），对应就是最佳上样量了。不过在实际测试中，样本浓度在平台要求的动态范围之内都是OK 的

对于20000个微滴，样本浓度的上限（理论上λ=5.5），对应的阳性微滴比例为99.6%，阴性微滴的比例为0.4%，对应阴性微滴的数量是80个。也就是阴性微滴数超过80个是OK的。其实理论上还可以更少，但是考虑到其他不确定度，这个数比较接近实测结果

答：微滴数量低于9000个，从统计学角度来说，抽样量太少，无法使用泊松分布校正，尤其对于高浓度样本来说，定量误差会比较大，检测上限也会降低。如果存在复孔，由于复孔间所有微滴都是独立反应体系，所以可以合并分析复孔数据，将多孔视作一孔。

对于QX200系统来说，如果反应体积是20微升，那么生成的微滴数在20000个左右。实际检测少于20000个，往往来源于系统的死体积、微滴转移时的损失及其他不确定因素。也就是说，微滴制备后，靶标核酸已经随机分布在20000个微滴中，阳性微滴的百分比已经确立，那么后续分析的微滴数量不到20000个，对定量的结果也是无影响的（浓度适合的样本）。实际上我们也遇到过，相同的样本，不同的批次检测，总微滴的数量从4000-20000不等，但是定量的结果无差别。注意，以上的说法前提是“浓度合适的样本”，如果样本浓度太高和太低时，分析的总微滴数偏少，会增加又一个环节的subsampling error,定量的准确性和精度就会受影响了。所以为什么定义8000个微滴，一方面是基于质控的角度。未达到这么多微滴，肯定是有问题的，建议重做；另一方面，对于浓度超高或超低的样本，8000个微滴带来的误差仍小于样本本身取样误差带来影响。

A：样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质，生成微滴时的环境温度，PCR时的等因素会影响微滴数量。血液样本中主要判断为蛋白残留以及提取过程中没有除尽的酒精。

答：引物探针一般都是用水或TE溶解，且在整个20微升反应体系内占比很少，所以对最终反应体系的离子强度或pH影响极低。且ddPCR反应预混合本身就是缓冲液，能维持相对稳定的pH。样本一般也是TE或纯水洗脱，如果提取没有问题的话那对体系也基本没有影响，唯一可能的情况是极高的盐离子浓度提高了微滴渗透压影响了内外相平衡，但一般人血为等渗溶液，不会有这么高的盐浓度，除非提取试剂盒有问题，过柱浓缩时洗不掉样品中过高的离子浓度。相比样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质来讲，离子对微滴的影响微乎其微。

A：最终测得有效微滴数量超过10,000个，1维图中微滴高度没有出现阶梯式排布，即可认为微滴稳定。

A：ddPCR实验有效性需要分几个方面区分：

理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。

对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。

A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中

A：1.单孔微滴数量不够，2. 单孔样本上样量不够，3. 需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度

A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论）

这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays, 到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。

如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。

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