蛋白电泳的检测技术

   2022-09-25 16:32:20 网络490
核心提示:血清蛋白电泳新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌,有助于许多临床疾病判断的参考,在各类教材书上已清晰的描述了各种病理现象所显现的图像,一般常见的是白蛋白降低,某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。如球蛋白多克隆(poly-clo

蛋白电泳的检测技术

血清蛋白电泳

新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌,有助于许多临床疾病判断的参考,在各类教材书上已清晰的描述了各种病理现象所显现的图像,一般常见的是白蛋白降低,某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。如球蛋白多克隆(poly-clonal)增高,β-γ融合的桥连现象,在γ区呈现细而密的寡克隆(oligoclonal)区带,及由单一克隆浆细胞异常增殖所产生的单克隆(monoclonal)免疫球蛋白区带,又称M蛋白(Monoclonal Protein)带,血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。

血清蛋白电泳目前最常用的检查方法是醋酸纤维膜电泳法。

免疫固定电泳

血清免疫固定电泳(Immunofixation, IF)技术是血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后,应用蛋白质固定剂和各型免疫球蛋白及其轻链抗血清,加于凝胶表面的泳道上,经孵育和扩散后,若有对应的抗原存在,则在适应位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色,根据电泳移动距离分离出单克隆组份,可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。血清免疫固定电泳技术用于M蛋白的型、亚型和轻链型,本周(Bence-Jonse)蛋白和游离轻链的分型和鉴别。

同工酶电泳

血清乳酸脱氢酶同工酶电泳

血清肌酸激酶及其亚型同工酶电泳

血清碱性磷酸酶同工酶电泳

血清碱性磷酸酶同工酶电泳具有三种不同结构的基因编码或在转移后修饰的结果,按其氨基酸序列可分为小肠型、胎盘型和组织非特异型(肝、肾、骨),它们各自表达产物可在血清中呈现,具有不同的意义。利用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)与ALP-L1和ALP-B糖链亲和力的不同,血清与WGA作用再经电泳后可将ALP同工酶予以分离。肝外胆道阻塞转移肝癌时,高分子ALP(ALP-L2)明显增高,在原发性肝癌时肝型ALP(ALP-L1)明显增高,骨转移性癌时ALP-B增高。

脂蛋白电泳

应用自动电泳系统可将血清中脂蛋白组份进行分离,呈现LDL、VLDL和HDL条带,输入TC值,计算各种脂蛋白中胆固醇含量,LDL-C/HDL-C比值在正常人群组与冠心病患者组存在显著差异(p<0.001);诊断临界值(cut-off point)为3.89,诊断灵敏度76.7%,特异性79.8%。LDL-C/HDL-C比值是粥样硬化性冠脉疾病重要的危险因子之一,明显优于胆固醇或其它血脂的单个含量指标,且随比值的增加,患冠脉疾病的危险性相应增大。

在凝胶中脂蛋白的等电点不同,不仅可区分α,前β和β区带,又因介质中含有抗LP(a)抗体及阳离子存在,抗LP(a)抗体与患者血清中LP(a)结合形成复合物,阳离子则抑制其它脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其它脂蛋白分离开来。清晰的LP(a)条带呈现在前β与γ区域之间,阳性条带扫描后,可获得区带的面积及其百分含量,提高了对心、脑血管独立的危险因子LP(a)检测的敏感性和特异性。

血红蛋白电泳

血红蛋白电泳可使正常血红蛋白HbA与HbA2分离,也可检测出大部分异常血红蛋白如:HbS、HbD、HbC和HbE。当HbA2、HbC和HbE>20%时,则难以分离和鉴别。应先用碱性琼脂糖凝胶血红蛋白电泳进行正常和异常血红蛋白的分离和检测,通常用于孕妇的筛选,然后再进行酸性琼脂糖凝胶血红蛋白电泳,对异常血红蛋白予以分离和鉴别。

血红蛋白遗传性分子病常分为异常Hb病和地中海贫血两大类。异常Hb病如镰状细胞贫血,在碱性缓冲液中异常HbS电泳区带的位置呈现在HbA与HbA2之间,异常血红蛋白的HbC和HbE电泳迁移率都十分缓慢,HbC和HbA2可重叠。在PH6.2的枸橼酸缓冲液的是琼脂糖介质电泳中,由于HbC不能与HbA分离,这样就可检测出HbE。异常血红蛋白HbD是在碱性缓冲液中其电泳迁移率如同HbS,而在PH6.2枸橼酸缓冲液的琼脂糖介质中,因HbS与HbA不能分离,这样就可以分离和检测出HbD。β-地中海贫血是HbA的合成受损,电泳图谱可呈现HbA2与HbF区带。

糖化血红蛋白电泳

非浓缩尿蛋白电泳

脑脊液电泳

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳条带为什么有宽有窄,有浓有淡?

做好血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的方法:

电泳时,电压应控制在 110 ~ 140V ,不能过高,若电压太高,产热量大,则蛋白质标本会破坏,并且电压高则带电颗粒移动速度快,分离效果不理想。

醋酸纤维素薄膜在电泳前,一定要在缓冲液中浸透,否则有碍电泳分离,最好是浸泡过夜,效果最佳。

点样时样品一定要点在无 光泽面,否则很难吸入,点样量 不宜过多(血清样品最适宜 3μl )。其原因是醋酸纤维素薄膜承受蛋白质有限。量过多则分子量相近的物质相互争夺迁移而重叠,影响结果观察。

电泳开始后,不能再取放薄膜,以防触电。如必需进行,要先关闭电源。

影响电泳的主要因素:

电泳介质 pH 值的影响 : 对于蛋白质和氨基酸等两性分子,电泳介质的 pH 值影响蛋白质的电离情况,即可决定蛋白质的带电量 (Q) 。 pH 值小于等电点,分子带正电荷,向负极泳动,如果 pH 大于等电点,分子带负电荷,向正极泳动。 pH 值偏离等电点越远,分子所带净电荷越多,其泳动速度越快。当缓冲液 pH 等于其等电点时,分子处于等电状态,不移动。由于血清蛋白质的等电点多在 pH4 ~ 6 之间,因此,分离血清蛋白常用 pH 8.6 的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 缓冲液。

缓冲液的离子强度 : 离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清晰;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清晰。如离子强度过低,缓冲液的缓冲量小,不易维持 pH 的恒定;离子强度过高,则降低蛋白质的带电量 ( 压缩双电层 ) 使电泳速度减慢。所以常用离子强度为 0.02 ~ 0.2 之间。

电场强度的影响 : 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算,也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长 15cm ,两端电压 ( 电势差 ) 为 150V ,则电场强度为 150 / 15=10 V / cm ,电场强度愈高,则带电粒子的移动愈快。 随着电场强度的增高,电流强度增加,产热也增多。产热的不良后果是: ① 引起水的蒸发,改变溶液 pH 及离子强度; ② 引起介质温度高,可使蛋白质变性。因此电泳必须控制电压在一定范围之内,当进行高压电泳时,必须装备有效的冷却装置。

电渗 : 在电场中,由于多孔支持物吸附水中的离子使支持物表面相对带电,在电场作用下,溶液就向一定方向移动,此种现象称为电渗。如纸上电泳所用的滤纸纤维素带有负电荷;琼脂糖电泳中,所用的琼脂糖由于大量硫酸根的存在也带有负电荷,它们使水感应产生水合氢离子 (H+3O) 。在外电场的作用下,水向负极移动。如果被测定样品也带正电荷,则移动更快;如果被测定样品带负电荷,则移动减慢。所以电泳时,颗粒泳动所表现的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。因此在选用支持物时,应尽量避免高电渗作用的物质。

因为各种蛋白质的百分含量不同,所以粗细不同。颜色深浅由于含量以及蛋白对染色剂亲和力不同影响。

血清白蛋白和球蛋白正常值(表中数字为所占%)各部分醋酸纤维 蛋白质薄膜电泳纸上电泳白蛋白62~71 54~61球蛋白α1 3~4 4~6α2 6~10 7~9β7~11 10~13γ9~18 17~22。

白蛋白:62%--71%;α1球蛋白:3%--4%;α2球蛋白:6%~10%;β球蛋白:7%~11%;γ 球蛋白:9%--18%。

成分简介:

血清含有各种蛋白质,其等电点均在pH7.5以下,若置于pH8以上的缓冲液电泳时均游离成负离子,再向正极移动。由于其等电点,分子量和分子形状各不相同,其电泳速度就不同。

故可将血清中蛋白质区分开来。分子量小,带电荷多者,泳动速度最快。按其游动速度顺序把血清蛋白粗略分为清蛋白,α1、α2、β及γ球蛋白。

临床上血清白蛋白减少与γ球蛋白增高为肝病患者血清蛋白电泳所共有的现象,其减少与增加的程度和肝炎的损伤的范围相并行。

急性肝炎早期无变化,发病第二周后即有血清蛋白的改变,慢性肝炎较急性肝炎变化明显,肝硬化变化则更为明显。因此,血清蛋白的变化对疾病诊断和预后的评估具有重要的临床意义。

以上内容参考 百度百科—血清蛋白电泳

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