这里从PCR实验室布局、工作区域的主要功能和设备配置、实验室的通风系统及压力控制及其他注意事项来解说。
基因扩增实验又称PCR实验,其特点是能将微量的DNA大幅增加,PCR是分子生物学研究和实验的常规方法,广泛应用于生物学各个领域。
例如:艾滋病检测、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的检测和诊断,DNA指纹、个体识别、亲子鉴定及法医物证、动植物检疫,动物及其衍生产品检测,动物饲料、化妆品、食品卫生检测,转基因作物与转基因微生物检测等。
PCR实验室原则上为试剂准备区、样品制备区、扩增区和扩增产物分析区四个单独的工作区域并设有专用走廊,各工作区域应设缓冲间,工作区与缓冲间宜安装连锁装置。
不同功能的工作区应是分隔独立的,各工作区有明显的标志,不能直通,如果紧密相连,需安装物品传递窗。前两区为扩增前区,后两区为扩增后区,扩增前区与扩增后区应严格分开。
1、试剂准备区:主要进行试剂的制备、分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区,不得经过其它区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的试剂。本区主要设备有天平、冰箱、离心机、加样器、振荡器等。对于气流压力的控制,本区并没有严格的要求。
2、样品制备区:主要进行样品的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区主要设备有冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴等。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。
3、扩增区:该区域的功能是DNA扩增和扩增片段的测定。此外,反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液和已制备的DNA模板(来自标本制备区)的加入等也可在本区内进行。对于气流压力的控制,相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。
为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。该区域的设备主要是核酸扩增热循环仪、加样器、超净台等。
其中热循环仪的电源应专用,并配备一个稳压电源或UPS,以防止由于电压的波动对扩增测定的影响主要进行DNA扩增。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。
4、扩增产物分析区:扩增产物的测定。本区主要设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等。本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。
各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流,形成单向流程的保护屏障,避免实验之间的相互干扰,防止气溶胶扩散对实验过程造成污染。
PCR实验室并没有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式,严格控制送、排风的比例以保证各实验区压力要求。
另外,PCR实验室内通常有生物安全柜、通风柜等生产设备,这类设备排风量大且使用时间有间隔性,并不与空调系统运行时间一致,这就导致有这些设备的房间在设备启停的时候很容易失压,原本正常的压力梯度瞬间就破坏了。这正是PCR实验室空调系统设计的难点所在。
实验室围护结构应牢固、气密性好。所有阴阳角宜采用圆弧过渡,墙体内壁光洁、不积尘、耐腐蚀、易清洗消毒。地面使用PVC卷材或环氧树脂自流坪,材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。
PCR实验室的条件
1 科研建筑设计标准(JGJ91-2019)-喜格实验室工程
2 病原微生物实验室生物安全通用准则(WS 233-2017)-喜格实验室工程
3 医学生物安全二级实验室建筑技术标准TCECS 662-2020
4 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则(卫办医政发【2010】194号)
5 实验室生物安全手册(WHO第三版)
6 基因扩增领域检测实验室认可指南(CNAS-GL029:2018)
标准PCR实验室设计原则是什么?
1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出
由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它
有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广
泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍
2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求
荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书
PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班,并持证上岗。PCR实验室通过验收,实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行
5、必须在无菌无尘环境下进行操作
(一)标准PCR实验室的工作区
(1)试剂准备区
设置有实验桌、柜子、冰箱、可移动紫外灯、与标本制备区连通的传递窗和椅子,在实验桌上可放置实验仪器设备(包括离心机、震荡器、移液器、离心管、废液缸和垃圾筒等)。
(2)标本制备区
设置有实验桌、冰箱、生物安全柜、可移动紫外灯、水槽和椅子,在实验桌上和生物安全柜内还放置有实验仪器设备(包括离心机、恒温金属浴、移液器、离心管、废液缸和垃圾筒等)。
(3)PCR扩增区
设置有实验桌、柜子、与标本制备区连通的传递窗和椅子,在实验桌上放置有实验仪器设备(包括定量PCR扩增仪、电脑、打印机、废液缸和垃圾筒等)。前面设置有专用走廊,走廊的一侧是各实验区的缓冲区。三间实验区的布置依次为试剂准备区,标本制备区以及PCR扩增区。
(二)标准PCR实验室各工作区之间注意事项
(1)各工作区必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品滥用。
(2)进入各工作区域必须严格按照单一方向进行,即:试剂准备区→标本制备区→PCR扩增区。
(3)不同的工作区域使用不同的工作服,工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。
(三)气流方向设置
(1)为了防止环境对扩增产物的影响,按临床基因扩增实验室调协要求,各实验区的气流设置方向为:空气由试剂准备区流向缓冲区,标本制备区流向缓冲区,缓冲区流向PCR扩增区(如图3所示)。
(2)工作时,应使缓冲区、缓冲区和PCR扩增区为负压,其它各室为“0”压或“+”压。可打开缓冲区,缓冲区和PCR扩增区的排风扇往外排气,并且在实验区的外墙上各扇门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
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