获取一个基因CDS序列的方法如下：
打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）
然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!
正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。
点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。
最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。
这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如下引物：
好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终于到正题了！
待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。
首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：
模板的获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
about TRIzol
注意事项及原理
注意事项：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。
如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。
操作步骤
步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。
about Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
about 质粒抽提
实验原理：
较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。
注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。
注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。
注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
9、重复操作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤
11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。
可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。
一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：
2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:
Trizol提取RNA
巯基乙醇提取rna作用 Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚类氧化，若酚类氧化，则会形成醌（两个苯环），醌含有强自由基，会破坏核酸结构。 同时，由于PH值大于7，在碱性环境中DNA处于水相，RNA处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。 Tris饱和酚的配置： 1、冰箱取出重蒸酚，室温放置－－－68度水浴溶化，切勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂 2、加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，（原液14. 4MOL/ML），混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行） 3、加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层 4、加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相 5、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次，至PH为8.0 6、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中4度保存 7、如黄色消失或呈粉红色（说明酚已经被氧化），则不能使用 巯基乙醇提取rna作用机理 RNasin是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质，鼠肝RNasin分子量为40KD；来源于人胎盘的RNasin分子量为51KD，等电点为4.7，最适pH为7～8。RNasin能与RNase非共价结合（Ki=3×1010）从而抑制了它们的活力，RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。1mmol/L的二巯基乙醇对于RNasin的发挥抑制RNase的最大活性非常重要。 RNasin最好不要与某些蛋白质变性剂（如7mol/L的尿素）同时使用，因为尿素能使RNase-RNasin复合物分离，并释放出活性的RNase。 rna提取中乙醇的作用 1. 按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。 2. 一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。 3. 一般保存方法都是RNA溶解到无RNase的水中，然后-80度冰箱保存。 4. 反复冻融对RNA的长时间保存肯定是有影响的，可分成小量保存，尽量减少冻融。 5. 现在有些试剂公司有相关的产品，可用于保存RNA，不过可能会有植物或动物，细胞或组织之分。 二巯基丙醇怎么提取 二巯基丙醇古代叫砒霜解药，二巯丙醇为无色或几乎无色、易流动的澄明液体。有类似葱蒜的气味。在甲醇、乙醇或苯甲酸苄酯中极易溶解，溶于水，在脂肪油中不溶，可防止砷、汞、铋、金、锑等金属对身体组织的中毒作用。名称介绍 中文名称：2,3-二巯基丙醇；2,3-二氢硫基-1-丙醇；2,3-二巯基-1-丙醇；二巯基丙醇；3-羟基-1,2-丙二硫醇；巴尔；巴尔双硫代甘油；英国抗路易斯气剂 dna提取中巯基还原剂 DTT作用如下： 1、DTT的作用之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。 这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化。 2、DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。 但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS）。 反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。 DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25，纯度>99%。常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。 而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。 RNA提取中巯基乙醇如何除去 是 TRIzol有毒性，trizol中含有苯酚，苯酚是刺激性气味。对呼吸道有伤害，闻久了会有晕的感觉。 1、TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。 2、苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 巯基乙醇作用Rna提取 Trizol就是酚氯仿提取法的常用试剂 Trizol中有酚，异硫氰酸胍和B-巯基乙醇。他们的作用都是使蛋白变性，使蛋白质与核酸解聚。加入氯仿，用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，就是白色层，只有RNA分子留在水相，但溶液pH不在酸性范围内，会使DNA溶解在水相，所以使用时按照说明书要求根据细胞数或培养器皿底面积适量加入Trizol。最后异丙醇沉淀，将水相中RNA提取出来。 提rna加巯基乙醇 材料、试剂及器具 1、 材料 总rna提取物。 2、 试剂 (1)0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2)10x电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0) NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%) (4)10x电泳缓冲液 5 mL 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC水 36.5 mL 加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 (5)上样缓冲液：50%，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 (6)甲酰胺(去离子)。
哪位高手指点一下植物RNA提取试剂什么样的最好啊？
造成OD260/OD280偏低有两种情况：
1.DNA 污染
鱼类肝脏的DNA含量比较多。像你提到的加入异丙醇后又大量的白色絮状沉淀出现，极有可能是DNA没有去除干净。
造成DNA污染的原因主要是Trizol加入氯仿时混匀力度不够，造成DNA未被完全萃取。建议氯仿和trizol混匀时加大震荡力度。
2.蛋白质污染
吸取上清时吸取的上清过多，中间层的蛋白质。造成最后的蛋白质污染。严重影响提取RNA的纯度。
其实现在提取RNA，建议不要用Trizol。Trizol虽然是最经典的方法，但也存在着有机抽提（毒性较大），耗时较长，对操作者要求高等缺点。现行的硅胶柱能很好的解决这个问题。市场上Qiagen， Omega的产品都不错。Qiagen的价格稍高。
TRIpure Reagent Trizol总RNA提取试剂 哪家公司生产的好？
北京艾德莱的植物RNA提取试剂盒非常好用！他们有好几款植物RNA提取的试剂盒。
现在给您好提供一些资料，希望能帮助到您；
(1) 首先有两种选择：第一是用他们的RN01 TRIpure reagent，这个就是Invitrogen的TRIzol，他们的质量完全和进口一样可以100%替代进口TRIzol。 第二是用RN33 PLANTpure 通用植物总RNA快速提取试剂盒 （普通植物组织细胞）,这个试剂盒的原理，是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure（RN01）加离心柱子。
(2) 然后根据特殊具体需求比如想速度更快，操作更简单，还不想用TRIzol这种苯酚，氯仿毒性物质还有两种选择：一种选择是RN09 EASYspin植物RNA提取试剂盒，这个盒子和Qiagen的74904完全一样，不用苯酚，氯仿，速度最快，操作最简单。但是对部分植物样品来说，可能残留基因组DNA稍多，只有做了试验才知道客户的样品是不是残留DNA稍多，就是Qiagen也不能确保100%的样品没有残留DNA。北京艾德莱能确保的就是和Qiagen的效果一致。实在有DNA残留的，就可能还要用DNA酶消化。具体只能自己权衡选择或者和艾德莱技术人员沟通了再选择。另一种就是RN38 EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒这个试剂盒是RN09的改进版本（Qiagen也没有这款，是艾德莱在Qiagen基础上改进世界首创的），它使用基因组清除柱子的技术和配方在保持RN09不用苯酚，氯仿毒性物质，最简单，最快速的基础上消除了基因组DNA残留，一般肉眼不可见DNA残留。注意：目前北京艾德莱测试的几种植物样品中均已经获得成功，使用RN09提取有残留DNA的样品种类使用这款后，均无DNA残留。
希望我的回答能帮助到您好。
trizol，我用的少，我用的比较多的是typhon（往圣的）。给你发个typhon的说明书吧。
oneShine Typhon Total RNA Extraction Reagent 总RNA提取试剂是一种可以用于动物、植物、微生物、病毒总RNA抽提的试剂，具有极强的细胞或病毒颗粒裂解能力，可在短时间内裂解各种生命形式的基本单位。本品含有能够有效抑制RNase的有机试剂，最大限度地减少总RNA的降解。用本产品提取的总RNA纯度高，不含基因组DNA，可以直接用于Northern blotting、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。
经过本产品处理后，离心管中的液体分为三层，RNA在上层水相中，而中间层固体相和下层有机相中则分别包含DNA和蛋白质。因此可以对中间层和下层进行深度处理，以求获得总DNA和总蛋白；DNA的获取用乙醇沉淀即可，而蛋白质的获取则采用异丙醇沉淀法。
本产品操作简便快捷，可以在一小时内完成所有实验。
II运输与保存方法
采用冰袋运输4℃避光保存，有效期一年。保存时应封口密闭，不宜长时间暴露于空气中，以免产品遭到氧化而失效。
III注意事项
1．本产品中含有苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂，具有毒性和腐蚀性，操作时要做好保护措施并在通风橱内进行取用，不可掉以轻心。如果不慎接触皮肤或粘膜，应立即转移至通风场地并用大量的自来水冲洗或漱洗，必要时及时就医。
2．需自备氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水等（本公司均有售），所有吸头、离心管、PCR管、玻璃容器等要用DEPC水处理或高温烘烤后才能使用，防止RNase对总RNA的降解（本公司均有售）。
3．样品用Total RNA Extraction Reagent匀浆后，如果不加入氯仿进行下游实验，先-70℃冻存，可保存一个月以上。建议抽提总RNA后尽快进行后续实验，短暂保存应放置在-70℃中，只能冻融一次。
4．过多的样本量可能会导致裂解不充分，使产物纯度降低和污染。在吸取上清液时，不可贪多和焦急，吸取后所剩上清液的液面距中间层至少有2mm以上，以免吸取到中间层导致DNA的污染，使后续实验出现假阳性。
V操作流程
RNA的提取
准备试剂
氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤
1．匀浆处理
a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon；肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon，反复轻柔吹打，直至溶液不抽丝，样品体积不应超过Typhon体积10%。
b、单层培养细胞:去除细胞培养基，PBS冲洗一次，直接在培养板中加入Typhon裂解细胞，每250px2面积加1ml，用移液器吸打几次，转移至1.5ml离心管，反复吹打，直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c、细胞悬液:离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon，反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃ 12000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，轻柔振荡或吹吸15秒，室温放置3分钟。
5．2-8℃ 12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色或淡黄色水相，中间为固相。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Typhon试剂的60%。
6．把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7．2-8℃ 10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8．用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9．室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。
RNA的提取注意事项
1．从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品，离心取上清液后，异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加入Typhon，加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
RNA的提取常见问题分析
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65：
A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。
D.吸取水相时混了有机相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染:
沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，加入以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂
乙醇、0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH
操作步骤
1．样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2．移去上清，（如需要分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTyphon加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
3．用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清。
4．室温放置晾干DNA5-15分钟，用8mMNaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10细胞中分离的DNA溶于300-600μl8mMNaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE、HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物，可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量
取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。理论上，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量约分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。
分离DNA的应用
1．用于PCR 溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。
2．酶切反应 用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。每μgDNA使用3-5单位的酶,酶用量为3-5 IV/mgDNA。
DNA分离注意事项
1．DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存数月。
3．DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4℃或-20℃长期保存。
DNA的分离常见问题分析
得率低
A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70
A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中
B.酚除去不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染
A.氯仿分层后水相未完全去除
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗脱不彻底
蛋白质的分离
准备试剂
异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS
操作步骤
1．取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTyphon加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTyphon加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Westernblot或-5--20℃保存备用。
蛋白质的提取注意事项
1．蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5--20℃一年以上。
2．用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western blot。
蛋白质的提取常见问题分析
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解：
组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形：
蛋白质沉淀洗涤不充分
以上就是关于2020-08-24质粒构建全部的内容，如果了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！
